荧光偏振 (FP)
荧光偏振 (FP)
荧光偏振 (FP) 是一项广泛用于监测不断变化的结合事件的技术。可用于评估包括蛋白-抗体结合和 DNA 杂交在内的生物分子相互作用以及酶活性，适用于基础研究以及高通量筛选。
用平面偏振光激发小的荧光标记分子（示踪剂），因为示踪剂快速地翻转，它发出的发射光去偏振程度高。但当示踪剂结合一个比之大得多的分子时，它的旋转速度就会变慢，同时发射光仍然有大部分产生偏振。
荧光偏振 G 因子
偏振以 milli P 或 mP 为单位表示，其使用检测到的相对于偏振激发光方向的垂直 (Iperp) 和平行 (Ipara) 荧光强度测量值进行计算（参见下文的公式）。使用 G 因子 (G) 校正滤光片、偏振片和单色器等光学元件的影响，其中这些元件会影响偏振值。
未结合的示踪剂
结合更大分子的示踪剂
荧光标记的分子或与示踪剂结合的分子越大，mP 值就越大。
荧光偏振相比其他结合检测的优势
荧光偏振可以用来研究受体-配体相互作用、蛋白-DNA 相互作用、蛋白水解、膜流动性、酶测定等。荧光偏振检测已成功用于研究众多靶点，包括激酶、磷酸酶、蛋白酶、G 蛋白偶联受体 (GPCR) 和核受体。
以下优势使得荧光偏振检测特别适用于高通量筛选：
- 均相（无需清洗步骤）
- 非放射性
- 比率式（单波长）
- 微型化
在 SpectraMax 多功能微孔板读板机（酶标仪）上进行 IMAP 磷酸二酯酶的测定
Molecular Devices 的 IMAP® 技术可以对激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶进行快速、均相、非放射性测定，而且适用于检测开发和高通量筛选。IMAP 检测基于磷酸盐与纳米粒上固定金属配合物的结合。IMAP 结合实体与磷酸化底物结合时，肽的分子运动会被改变，附着于肽的荧光标记的荧光偏振 (FP) 会增加（图 1，左图）。在时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 实验中，有磷酸化底物时，使用铽 (Tb) 供体会引起荧光能量转移（图 1，右图）。这项实验在时间分辨模式下进行检测，几乎消除了来自实验组分或筛选化合物的荧光干扰。TR-FRET 还能灵活改变底物大小和浓度。
环核苷酸磷酸二酯酶 (PDE) 是一组可降解 cAMP 和 cGMP 磷酸二酯键的酶，其中 cAMP 和 cGMP 是参与各种生物过程的第二信使。它们在心脏病、痴呆症、抑郁症等领域具有临床意义，是一类关键的可用药靶标。在此处，我们展示了如何使用 SpectraMax® 多功能微孔板读板机和 SoftMax® Pro 软件并采用 IMAP 技术来测定 PDE 酶稀释和抑制曲线。
IMAP 偏振和 TR-FRET 磷酸二酯酶实验原则
图 1：使用荧光标记的底物进行磷酸二酯酶反应。随后添加包含较大M(III)基底纳米粒的结合溶液。在荧光偏振读数（左图）中，较小的磷酸化荧光底物结合较大的纳米粒会降低底物的旋转速度，并增加其荧光偏振。在 TR-FRET 读数（右图）中，磷酸化底物和铽供体均结合纳米粒，从而使铽供体靠近底物上的荧光素受体并实现荧光共振能量转移。
简化在细胞株开发中测定 IgG 的工作流程
在单克隆抗体开发和生产的许多阶段，测定 IgG 的产生是关键步骤。常用的 IgG 定量测定方法要么需要特殊仪器和娴熟人员，例如高效液相色谱法 (HPLC) 和表面干扰量度法，要么需要耗时的测定法，例如酶联免疫吸附检测 (ELISA)。尽管 ELISA 是一种受到广泛认可的蛋白定量方法，但过程时间长，步骤多。此处，我们介绍了在抗体开发和生产过程中通过 Valitacell 的 Valita®TITER 实验来测定 IgG 效价的方法。
基于荧光偏振 (FP) 技术 ValitaTITER 实验可以用来检测 IgG Fc 与蛋白 G 的相互作用。96 孔微量滴定板的每个孔都涂有荧光标记的 IgG 结合肽蛋白 G。向孔中添加样本时，蛋白 G 分子重悬并与之发生结合。蛋白 G 结合抗体时，其分子运动的速度下降，从而导致荧光偏振值升高（图 2）。
使用荧光偏振技术的 ValitaTITER 实验原则
图 2：在缓冲溶液中，游离蛋白 G 分子更小且旋转速度更快。因此，偏振激发光会发生失偏振（顶图）。当蛋白 G 分子结合样本中的抗体时，这种增大复合体的旋转速度就会下降，从而导致荧光偏振值升高（底图）。