TRF(时间分辨荧光)、TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移) 和 HTRF(均相时间分辨荧光)

时间分辨荧光 (TRF)

使用荧光素等传统荧光基团检测荧光强度 (FI) 时，荧光素的发射半衰期很短，大约只有数纳秒。样品的激发和发射光的检测会同时进行。尽管微孔板读板机可以将发射光中的激发光筛选后有效去除，但这种激发光干扰、微孔板材质和待检测物质自发光等短半衰期光信号经常会干扰待检测荧光信号，导致高背景。

时间分辨荧光 (TRF) 通过使用铕或铽等能够发射长半衰期荧光信号的镧系元素作为荧光基团来降低背景信号值干扰。这种长半衰期荧光信号可持续数毫秒，因此可以使用脉冲光源（如氙闪灯）激发荧光基团，隔一段时间再进行发射信号检测（“计数窗”）。短半衰期荧光（仅持续数纳秒）在信号检测之前就会消失。使用时间分辨荧光进行测定可大大降低信噪比。最常使用的镧系元素是铕、铽和钐。这些镧系元素通常以螯合物或穴合物的形式应用以获得优质的信号强度和稳定性。

时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET)

无 FRET FRET

供体和受体为远处供体，受体靠近

TR-FRET 结合了时间分辨荧光检测技术和荧光能量共振转移检测 (FRET) 技术。在 FRET 实验中，生物分子（如蛋白等）被荧光基团供受体标记。当生物分子之间相互作用，供受体荧光基团的距离被拉近。此时，若供体被激发，它会传递它的发射光能量给受体。受体和供体的发射光具有不同的波长，可以被微孔板读板机区分，从而定量生物分子之间的相互作用。

使用镧系元素荧光基团作为供体，发射光有很长的半衰期，TR-FRET 可以利用时间分辨检测荧光，消除短半衰期背景荧光的干扰。在 TR-FRET 实验中，由于供体荧光基团发射光有较长半衰期，供受体荧光基团的激发和发射都可以在短半衰期背景荧光消失后再检测。

均相时间分辨荧光 (HTRF)

HTRF 是一种通用的 TR-FRET 技术，该技术由 Cisbio 发明，用于检测生物分子间的相互作用。典型的 HTRF 检测把铕穴状化合物用作供体，有机荧光团 d2 用作受体。供体和受体可以被用于标记各种生物分子，应用范围包括表观遗传学，生物标志物定量，GPCR 信号转导等。HTRF 检测需要一个经 Cisbio 认证能兼容 HTRF 的带 TRF 检测模式的微孔板读板机。